Research Focus
簡介 環型核醣核酸(circular RNA)為近年來備受矚目的一群新穎非編碼性核醣核酸(noncoding RNA)。一般來說細胞轉錄出來的核醣核酸多需要經過核醣核酸剪接(splicing)的過程；此過程中，外顯子(exon)會以線性的關係依次由上游至下游串接起來，而內含子(intron)則被移除。然在某些特定目前尚未完全了解的狀態，下游的外顯子會與上游的外顯子背向對接（backsplice）形成環型結構（圖一A，左圖）。
圖一A. 形成環型核醣核酸外顯子兩端的內含子長度一般較長，可以透過序列的互補或是核醣核酸結合蛋白的交互作用，進而促成背向對接。B. 環型核醣核酸的生成也可由跳讀的外顯子套索結構經由第二次的剪接所形成。(以上示意圖節錄於(4))
環型核醣核酸在病毒的世界裡並不算少見，然而科學界對於高等生物細胞是否可以產生功能性的環型核醣核酸卻一直沒有共識。早在90年代，學界已經觀察到人類與小鼠細胞可以製造出環型核醣核酸，然而在不了解其功能下，一般咸認其為核醣核酸剪接過程所產生的錯誤產物。在這近十年次世代定序技術的蓬勃發展與高速運算能力的提升下，學界可以有更宏觀的角度重新檢視環型核醣核酸在細胞內扮演的角色。2012年是環型核醣核酸引起眾人關注重新被重視的一年，三個獨立的研究小組各自發表了使用次世代定序所做出的分析，提供在多種高等生物細胞中環型核醣核酸皆普遍地表現的關鍵證據(1-3)。
環型核醣核酸生成的分子機制 環型核醣核酸多從編碼性基因（即一般產生蛋白質的基因）所產出，且沒有U2或是U12剪接體的偏好傾向。目前被大家廣為接受的生成機制有兩大類：第一類為透過會形成環型核醣核酸外顯子區域的上下游內含子序列互動。泛基因體分析的結果顯示，會形成環型核醣核酸外顯子區域的上下游內含子長度一般較長，因而可以促進序列間的交互作用。此序列間的交互作用可以是單純的互補性序列配對(pairing of complementary sequences)或是透過核醣核酸結合蛋白(RNA binding protein)互動，進而促進背向剪接的發生；第二類生成機制則與選擇性剪接(alternative splicing)中的外顯子跳讀(exon skipping)息息相關，在外顯子跳讀的過程中，被跳讀的外顯子會被核醣核酸剪接體當成內含子一般地移除，而形成套索結構(lariat)。此一套索結構有機會再進一步被核醣核酸剪接體處理成環型核醣核酸（圖一B）。
環型核醣核酸的分子特性與功能 環型核醣核酸在化學組成上有別於核醣核酸剪接過程中產生的套索結構(lariat)是以5’-2’鍵結的方式閉合，環型核醣核酸則是以一般鹼基間相同的5’-3’所鍵結；也因為如此，其不具一般訊息核醣核酸的5’端帽(5’capping)與3’端的多聚腺苷酸尾（poly-A Tail），而被認為在細胞中具有高度穩定性。環型核醣核酸具有許多面向的分子功能，其中最被廣泛研究的功能為吸附微小核醣核酸(miRNA sponge)以抑制其活性，進而促進微小核醣核酸標的基因的表現量；當作微小核醣核酸吸附體的環型核醣核酸一般皆位於細胞質內，與其可以和核醣核酸誘導靜默複合體(RNA-induced silencing complex, RISC)結合，增進訊息核醣核酸(messenger RNA, mRNA)穩定度的功能一致。2012年的報導即是以ciRS-7環型核醣核酸為例，舉證其具有數十個(>70) miR-7微小核醣核酸的結合位點，因此可以調控miR-7標的基因的表現量。除了透過吸附微小核醣核酸來調控基因的表現量外，還有一特殊類別的環型核醣核酸具有未移除的內含子(retained introns)，被特稱為外顯-內含子環型核醣核酸(Exon-intron circular RNA, EIciRNA)。此類環型核醣核酸可以存留於細胞核中透過與基因啟動子(promoter)的結合，進一步招募核醣核酸聚合脢(RNA polymerase II) 直接參與轉錄的調控。然而，外顯-內含子環型核醣核酸如何選擇性地調控特定基因轉錄的機制目前仍然沒有定論。與吸附微小核醣核酸功能概念相仿的功能還有吸附核醣核酸結合蛋白（RBP sponge），核醣核酸結合蛋白顧名思義是透過與標的核醣核酸有交互作用才可達到分子上調節的功能，因此環型核醣核酸若能與標的核醣核酸競爭核醣核酸結合蛋白，便能達到調控的作用。
除了調控基因的表現量之外，環型核醣核酸也被報導可以調控其宿主基因(host gene)的剪接過程。由於生成環型核醣核酸與訊息核醣核酸的剪接過程中，剪接體、調控剪接的核醣核酸結合蛋白與序列上的剪接位點(splice sites)都是共用的，因此會有競爭相互抑制的關係。現有的文獻中，咸認環型核醣核酸的表現可以抑制宿主基因的剪接過程。環型核醣核酸與蛋白質的交互作用另有其他的分子功能：在多篇文獻中(詳參(4))，環型核醣核酸被報導具有細胞鷹架的功能，可以橋接兩個蛋白質之間的結合，像是由FOXO3所產生的環型核醣核酸可以促進p21與CDK2的結合。另外，環型核醣核酸不只可以正向地當作橋接的平台，也可以抑制特定蛋白質間的交互作用。另外，也有文獻指出環型核醣核酸可以抑制核糖體RNA的生合成，惟詳細分子機制仍不明。最後，少數的環型核醣核酸被證明也可以與核糖體結合，甚至轉譯出蛋白質來，這些異於宿主基因所產生的蛋白質究竟有著什麼樣的生物功能，也正挑戰著科學家們！
圖二 A. 環型核醣核酸於大腸直腸癌組織中由基因特定位置產出的比例。B. 環型核醣核酸CCDC66、CCNB1與CDK13在大腸直腸腫瘤細胞株 HCT116 與 HT-29中以RT-PCR檢驗的結果(上半部，使用檢測背向對接的引子；下半部檢測線性核醣核酸的引子)。-RT 為進行RT時，不加入反轉錄脢。NC為進行PCR時，使用水作為控制組。C. RT-PCR 檢測核質與細胞質中特定核醣核酸的分布。RNU6B為核內核醣核酸;rRNA為細胞質內核醣核酸;環型核醣核酸為檢測的標的。D. 環型核醣核酸CCDC66於臨床檢體中的表現量(N：非腫瘤組織；P：息肉組織；T：腫瘤組織)。E. 大腸直腸癌病人五年內的存活曲線，以環型核醣核酸CCDC66的表現量作為分群的標準。(以上結果節錄於(5))
環型核醣核酸在腫瘤生物學的發展與應用 在投入環型核醣核酸研究初期，有關在人類腫瘤上的資訊並不多，只知道腫瘤組織所表現的環型核醣核酸種類較為多樣；另外，基於相關性分析結果，文獻指出腫瘤組織的環型核醣核酸表現量較低，但都缺乏功能性的探討。因此，我們決定測試環型核醣核酸在人類癌症中扮演致癌基因角色的假說 (5)。為了逐步驗證這個假說，我們採用由成對癌變組織與癌組織旁非癌變組織的次世代定序結果作為分析的材料。由大腸直腸癌的次世代定序結果，我們使用生物資訊的工具找到了 74 組可能的背向對接事件。這些背向對接事件多發生於蛋白質基因的編碼區 (coding sequence, CDS)，少數橫亙於5’與3’非轉譯區（圖二A）。為了更進一步確認生物資訊分析的結果為真，我們使用定量PCR的方式檢視這些環型核醣核酸是否於人類細胞中表現。結果顯示環型核醣核酸 CCDC66、 CCNB1 與 CDK13 皆可被檢測出，並通過核醣核酸酵素R(RNase R)的檢驗（圖二B）。核醣核酸酵素R為一核醣核酸外切酵素(exoribonuclease)，因此不具 5’ 或 3’ 端的環型核醣核酸不會受到核醣核酸酵素R的降解。我們的結果也顯示這些環型核醣核酸多位於細胞質中（圖二C），與調控微型核醣核酸的功能有著高度的相關性。接著為了確認這些環型核醣核酸是否在腫瘤組織中確實高量表達，我們更進一步使用定量 PCR 的方式在 131 組臨床腫瘤組織、44 組癌化前息肉組織與76組非腫瘤組織間比較其表現量，結果顯示環型核醣核酸 CCDC66 在癌化前息肉組織即已異常表現，癌化後的表現量更劇增加（圖二D）。另外，以環型核醣核酸CCDC66表現量將病人分為低、高兩群，較高的病人有著較差的癒後表現（圖二E）。這些結果暗示環型核醣核酸CCDC66在大腸直腸癌可能扮演了致癌的角色。
為了更進一步研究環型核醣核酸 CCDC66 的致癌機制，我們設計了針對背向對接點 (backsplice junction)的小干擾核醣核酸來下調環型核醣核酸 CCDC66 (circCCDC66 knockdown) 的表現量。結果顯示大腸直腸癌腫瘤細胞株在環型核醣核酸 CCDC66 下調的情形下，其生長、入侵與爬行能力皆呈低落狀態。相反地，若是讓大腸直腸癌細胞株過量表現環型核醣核酸 CCDC66，則可促進細胞生長與 DNA 合成。說明了環型核醣核酸 CCDC66 的確在組織癌化過程中扮演了重要的角色。然而環型核醣核酸 CCDC66 是怎麼促進癌化的呢？我們的微小核醣核酸結合位點分析發現環型核醣核酸 CCDC66 雖然沒有如同環型核醣核酸ciRS-7具有針對單一微小核醣核酸的高密度結合位點，其卻具備了 102 個微小核醣核酸結合位點。這 102 個微小核醣核酸結合位點分屬於 101 個微小核醣核酸，這個結果讓我們設立了環型核醣核酸可以透過與多種微小核醣核酸結合進而調控基因表現的假說。
為了更進一步驗證這個假說，我們將這 101 個微小核醣核酸的標的基因由資料庫中篩選出來。如果我們的假說為真，這些基因應該會與致癌基因有高度相關，而與抑癌基因較無相關。結果顯示在大腸直腸癌組織中異常表現的致癌基因多為環型核醣核酸CCDC66的標的基因(37.5%)，反之只有20%的抑癌基因會受環型核醣核酸CCDC66影響。因此，此結果說明了環型核醣核酸CCDC66選擇性地保護了致癌基因，因而促進致癌基因的表現。接著我們在大腸直腸癌細胞株過量表現環型核醣核酸CCDC66，並檢測環型核醣核酸CCDC66的所調節的致癌基因，像是DNMT3B、EZH2、MYC與YAP1，皆可觀察到這些基因表現量上調的現象(圖三A)。我們更進一步證明這些基因的確是環型核醣核酸CCDC66透過拮抗微小核醣核酸所導致的現象：我們以MYC例子，使用3’-UTR報告基因檢測法(3’-UTR reporter assay)證明在環型核醣核酸CCDC66下調所導致的MYC低3’-UTR活性，可被微小核醣核酸的抑制劑所回復(圖三B & C)。
圖三 A. 受環型核醣核酸CCDC66調控的致癌基因在環型核醣核酸CCDC66過度表現情形下的表現量。B. MYC 3’-UTR報告基因的示意圖，其3’-UTR具有兩個受環型核醣核酸CCDC66調控的微小核醣核酸。C. 3’-UTR報告基因檢測的結果。D. 由皮下注射大腸直腸癌細胞株在環型核醣核酸CCDC66下調的情況下所收取的腫瘤，下方為腫瘤生長曲線。 E. 原位腫瘤模式，上方為外觀圖，黃色圈選區為腫瘤大概區域；下方為H&E染色結果：粉紅色為平滑肌層，紫色為腫瘤細胞，黃色虛線為平滑肌與腫瘤間的界線。F. 轉移至肝臟的腫瘤團塊。(以上結果節錄於(5))
最後，我們在小鼠身上以皮下腫瘤的模式展示大腸直腸癌細胞株在環型核醣核酸CCDC66下調的情況下，腫瘤生長會受到嚴重的遲滯(圖三D)。為了更進一步貼近大腸直腸腫瘤在人體的生長情形，我們將大腸直腸癌細胞株送回小鼠的盲腸，並觀察環型核醣核酸CCDC66下調對腫瘤的生長的影響。如圖三E顯示近端腫瘤組織的侵入能力受到環型核醣核酸CCDC66調控，由控制組細胞所長成的腫瘤可以入侵腸道的平滑肌層；而由環型核醣核酸CCDC66下調組生成的腫瘤則可被控制在上皮組織層，其與平滑肌層間的界線可被良好地維持。小鼠原位腫瘤的模式亦與人類大腸直腸癌有著類似的遠端轉移傾向，患者多可在肝臟發現轉移的癌細胞。在小鼠原位腫瘤的模式中，我們亦發現環型核醣核酸CCDC66下調組生成的腫瘤不易在肝臟建立遠端轉移(圖三F)。因此，綜觀我們在大腸直腸癌上對環型核醣核酸的研究，我們確立了第一個有著多面向證據支持的致癌環型核醣核酸，其具有同時拮抗多個微型核醣核酸並選擇性地保護致癌基因的新穎特性。
目前大腸直腸癌為所有癌症中盛行率最高的癌症，在台灣與全球為癌症中致死率排名第三的癌症，每年有超過一萬人的新確診病例。『早期檢測，早期治療』是提高癌症治療後生存率的不二法門，目前國內大腸鏡篩檢息肉與腫瘤或糞便潛血雖已有長足的推廣與普及，但若能以環型核醣核酸CCDC66為範本，發展出更便利省時檢測息肉組織或癌化組織的分子篩檢，將為個人、家庭與社會省下極大的成本。治療方面，對於大腸直腸癌的治療按照期別有著不同的處置，一般皆不脫手術移除、放射線治療與化學療法或綜合行之。然而，一旦腫瘤復發，伴隨而來的是更快的病程演進。因此，尋找新的治療標的並發展相對應的療程，將可能為經過第一輪治療的病人爭取到更多的時間。在我們的研究中，我們以初步驗證異常的環型核醣核酸表現為一新的致癌機制，其調控的細節雖仍尚未有完整的解答，但已為可能發展的新療法開了一扇窗。
參考文獻
1. Hansen TB, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature 2013; 495:384-388
2. Wu Q, et al. Homology-independent discovery of replicating pathogenic circular RNAs by deep sequencing and a new computational algorithm. Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:3938-3943
3. Salzman J, et al. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One 2012; 7:e30733
4. Hsiao KY, et al. Circular RNA - New member of noncoding RNA with novel functions. Exp Biol Med (Maywood) 2017; 242:1136-1141
5. Hsiao KY, et al. Noncoding Effects of Circular RNA CCDC66 Promote Colon Cancer Growth and Metastasis. Cancer Res 2017; 77:2339-2350